1940年8月4日，周恩来出席在延安召开的中央政治局会议，周一方面批评新四军未积极执行中央向北发展的方针，在与国民党的谈判中也未坚持党的立场；但同时，周再次提出，东南局仍以项英为书记。周恩来的这番表态具有重要的意义。1940年，毛泽东在远离江南的延安，隔着千山万水，凭着电报对新四军实施具体指导。惯于为自己留退路，以显示自己在任何情况下都料事如神的毛泽东，在给项英的电报指示中，前后矛盾，变化无端。毛既要项英尽速作好北渡转移的准备，又要项英维持“拖”的局面，来配合延安部署对国民党的谈判斗争。毛忽而判断国民党大军进攻在即，要求皖南部队立即分批移动；忽而又命项英向重庆要开拔费，要饷弹，“再拖一两个月”，致使项英无所适从，始终难以最后确定新四军北上的时间和路线。而毛泽东只看结果，不管过程，有理三扁担，无理扁担三，在延安对项英吹毛求疵，百般指责。中央政治局的大多数成员也随看毛泽东的调子，对项英多方挑剔。江南新四军所处的环境与华北八路军完全不同，国民党在江南留有强大的兵力，新四军的活动与发展受到很大的限制，加之项英的领导确有缺失，对国民党顾忌较多，这些都严重削弱了项英在党内的地位。1940年11月中旬，延安决定成立华中新四军、八路军总指挥部，令项英在部队移动安排就绪后，返回延安参加“七大”。在项英地位岌岌可危的时刻只有周恩来能体谅项英进退两难的苦衷，强调项英在东南局和新四军的领导作用，竭力维护项英在新四军中的威信。
周恩来在处理与国民党关系上的稳健态度及对项英的善意和宽容，都被毛看在眼里，毛只是需要选择适当的时机向周恩来表明自己的不满。
1939年1月5日，在没有任何特殊迹象的情况下，毛泽东公然推出一项旨在削弱周恩来权力的行动。是日，毛隐身其后、以延安中央书记处的名义，致电在重庆的周恩来，无端改变1939年9月26日中央政治局关于设立南方局的决定，提议将华南及西南各省合并成立的中央局（即南方局）易名为西南局。此决定如果一经最后确定、必然大大降低南方局作为中共在延安之外领导南中国党最大的派出机关的地位，而将南方局等同于地位较低的北方局（杨尚昆）、中原局（刘少奇）等其它派出机构。周恩来立即对延安的这封电报作出回应，1月7日，周与在重庆的另两位政治局委员博古、凯丰共同联名，覆电中央书记处，强调新设立的中央局“以南方局名称为好”。只是在周恩来、博古、凯丰的强烈要求下，毛泽东才作出让步，于1月13覆电，同意仍沿用南方局的名称。
对于周恩来直接领导的南方局的工作，毛泽东的态度也是模棱两可的。1939年8月24日，毛在中央政治局会议的发言中，一方面称赞南方工作“做得好，各省工作有成绩”，并指出“这是在恩来领导下的成绩”。但是，毛紧接看话锋一转，开始尖锐指责南方“党不巩固”，“群众运动不深入”，“统战没有中层阶级更大的发展”。周恩来对于毛的批评迅速作出反应，在当天周所作的会议结论中，周承认南方局在巩固党、利用合法机会做群众工作不多，周还检讨了在统战中“偏重了联蒋”，“对中产阶级团结不够”。
和周恩来小心翼翼、努力协调与毛泽东的关系全然不同，毛则不时示周以颜色，让周明确地体会到两人的关系已今非昔比。1940年3月26日，周恩来、任弼时、蔡畅等从莫斯科返抵延安，尽管在抵达延安的前一天，周恩来在甘泉就和毛通了电话，但是当周抵达时，毛却仍在睡觉，“只有李富春前来迎接，而且主要还是接他的夫人蔡畅”。
两年后，毛却亲自迎接从莫斯科返延的地位远低于周恩来的林彪。这一回毛不睡觉了，他挽看林彪的手步入杨家岭他居住的窑洞。毛对周、林的亲疏之别，一目了然。尽管毛有意怠慢周恩来，周却处处关心、体贴毛。1940年2月下旬，周恩来一行自莫斯科启程返国时，共产国际为周等准备了两大箱西式食品和烟酒，以备旅途食用。周却提议旅途中改用中餐，将这两箱洋式点心万里迢迢带回延安。返回延安后，周又亲自检查食品箱，命令将其送给毛泽东夫妇享用。毛固然对周之细心周到心领神会，但对周的态度始终未越过公事公办的界限，这就使周永远感到头顶上有一个紧箍咒存在，至死不敢稍有懈怠。
1938年后，毛泽东准确地利用了周恩来的性格特点，对待周，有扬有抑，有紧有松，成功地瓦解了周恩来与王明的联盟，并重新理顺了毛、周关系。对于毛而言，周恩来是须臾不可缺少的股肱，周的崇高声望、非凡才干和对中共事业的献身精神，使周成为任何人都难以取代的人物。更重要的是，毛了解周没有争当中共领袖的权欲，对毛毫无威胁。周既非王明集团成员，又与苏联和共产国际关系深厚，是可以代表毛与斯大林打交道的最合适人选，这一切都可使毛继续重用周。但是，毛绝非是一个能轻易忘记过去的人，周在1931至1935、1937至1938年两次与王明联手孤立毛的往事，使毛刻骨铭心，难以忘怀。周恩来身上散发着的那种儒雅、高贵的气质，也与毛一身的“山大王”气质格格不人。因此，毛时不时就要借机敲打一下周恩来，并执意提拔刘少奇作中共第二号人物，将刘作为制衡周恩来的工具，以防周恩来在党内形势发生突变的关头，再一次弃毛而去。
为了打下中共的江山，毛泽东必须借重周恩来的才干和忠诚；周恩来也在与毛的长期共事中，发现毛具有自己所缺乏的可作“人主”的霸气，断定凭藉这股霸气，毛能够一统江山。因此，周以其独有的机敏和灵活，很快适应了与毛的合作关系。在这种关系中，毛居于主导地位，周则安于作一个辅佐性的角色。由于毛、周都重视对方对自己的价值，各守分际，因而两人的合作虽时兴波澜但仍弥久而不坠。只是三十年代末至四十年代初，毛、周合作的关系还刚刚建立，毛对周还有太多的怨气没能尽兴宣泄，故而毛有意让周体会上下不落地的虚空，使周恩来在很长时间内搞不明白自己在中共核心层中究竟处于何种地位。这种由毛一手制造的对周恩来的慢性精神虐待长达七年，直到1945年中共七大召开才告一段落，使周恩来进退失据，有苦难言，为自己昔日的“过失”付出了沉重的代价。
